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恒遠文獻:肝郁脾虛泄瀉大鼠模型的建立及評價

點擊次數:118 發布時間:2020/1/3
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肝郁脾虛泄瀉大鼠模型的建立及評價
張慶業1,廖小紅1,范麗霞1,涂星1,2,房財富3,唐洪梅1
( 1. 廣州中醫藥大學第一附屬醫院,廣州 510405; 2. 廣州中醫藥大學,廣州 510006;
3. 中山大學附屬腫瘤醫院藥學部,廣州 510407)


【摘要】 目的 采用多因素刺激方法建立吻合人類“肝郁脾虛泄瀉”疾病特征的大鼠模型,并選取操作簡單、結論實時、科學經濟的評價指標。方法 將幼年 SD 大鼠隨機分為空白組和模型組,模型組采用母嬰分離、束縛刺激、直腸醋酸刺激三種因素復合造模,選擇不同時間測定大鼠體重變化、直腸敏感性、大鼠糞便分型積分及糞便含水量等指標,客觀驗證肝郁脾虛泄瀉模型是否成功。結果 模型大鼠出現食欲減退,飲水量增大,尿液減少的病理現象,部分大鼠出現活動增加、甚至躁狂。糞便積分在 5 ~ 7 分,糞便含水量遠遠高于正常組大鼠,而腸道敏感性顯著增加。結論 該模型較好的模擬了肝郁脾虛泄瀉的臨床表現,能滿足該類疾病的相關研究。
【關鍵詞】 肝郁脾虛泄瀉; 動物模型; 母嬰分離; 直腸敏感性

中醫學認為,肝屬木,主疏泄,喜條達而惡抑郁;脾( 胃) 屬土,主運化,脾氣宜清宜升,胃主受納腐熟,胃氣宜降宜和,共同完成機體對飲食物的消化吸收和輸布功能。若肝失疏泄,脾失運化,發為“肝郁
脾虛”,容易引起慢性泄瀉,與西醫病癥腸易激綜合征( IBS) 癥狀相似[1 - 3]。肝郁脾虛泄瀉可見于許多疾病,如腸易激綜合征、慢性胃炎、消化性潰瘍等,在臨床上的十分常見,如腸易激綜合征在青少年人群中患病率就高達 10% ~ 20%[4]。國內外眾多學者從肝郁脾虛泄瀉臨床癥狀特點出發建立了多種模型,取得了一定的成果,但研究中還存在模型的建立與中醫發病機理不完全符合、評價指標未能量化表示等問題[5,6]。本研究依據肝郁脾虛證的發病學說,運用精神 - 神經 - 外周刺激三種因素復合造模法構建肝郁脾虛證大鼠模型,模擬出符合肝郁脾虛證候及泄瀉特點的模型,并且通過可量化測定、操作性強的多項指標評價模型,使模型可以重復操作。
1 實驗材料
1. 1 動物及飼養初生 SPF 級 SD 大鼠 4 窩( 30 只) ,購自廣州中醫藥大學實驗動物中心【SCXK( 粵) 2013 - 0020】,雄雌不限,與母鼠同籠,第 14 天后斷奶并與母鼠分籠,在廣州中醫藥大學第一附屬醫院實驗中心 SPF級實驗環境下操作【SYXK( 粵) 2013 - 0092】,常規攝食飲水,光照為保持晝夜節律各 12h。溫度控制在 18 ~ 24℃,相對濕度控制在 50% ~ 70% ,實驗時室溫維持在 24 ~ 26℃。
1. 2 試劑和儀器
醋酸; yi醚; 4% 甲醛; 靜脈留置管; 石蠟油; HE染色 液; 龍 膽 紫 液; 0. 01 mol /L PBS 緩 沖 液 ( pH7. 4) ; 75% 酒 精; 二 甲 苯; 中 性 樹 膠; 生 理 鹽 水;1 mL、5 mL、10 mL 注射器; 手術膠手套; 電子秤; 血壓計; 大鼠血管活性腸肽 ELISA 檢測試劑盒( 含量≥99% ,規格: 96T,上海恒遠生物科技有限公司) 。2 模型制作與評價方法
2. 1 動物分組和造模[5]實驗用幼年 SD 大鼠從出生第 2 天起開始造模,隨機分為正常對照組( n =10) 、模型組( n = 20) 。肝郁脾虛泄瀉模型組: SD 乳鼠從第 1 ~ 7 天適應性飼養,從第 8 ~ 21 天,將乳鼠每天取出單獨小籠飼養2 h,再將乳鼠用yi醚麻醉后,用自制的直腸刺激注射裝置經石蠟油潤滑后輕柔地插入肛men,在 8 ~ 14 d時插入約 3 cm,在 15 ~ 21d 時插入約 5 cm,每次插入穩定后,注入 0. 5% 的醋酸每次 0. 4 mL /d,注入醋酸后,注射管在腸內停留 1 ~ 2 min,以免醋酸流出。在 22 ~ 35d 時大鼠用紙帶束縛前肩、前上肢及胸bu,束縛時間為 2 h /d,期間單獨分離飼養,不限活動。正常對照組按相同處理方法直腸注射生理鹽水,不做束縛處理。造模時,幼鼠放置到單獨的小籠造模,造模完畢后放回與母鼠同籠飼養,第 42 天造模結束。
2. 2 模型的評價及機理分析
2. 2. 1 大鼠體重及行為學評價記錄大鼠在實驗過程中飲水、食欲、活動情況等變化,在造模開始的第7、35、42、49、56 天進行稱量大鼠體重,取三次測試的平均值,比較模型組與對照組大鼠體重情況。
2. 2. 2 大鼠糞便 Bristol 分型積分及含水量測定在造模開始的第 35 天、第 49 天、第 63 天進行測試大鼠糞便分型評分,取三輪測試的平均值,并測定糞便含水量,判斷其是否屬于便秘還是腹瀉。糞便測試方法如下: 每天將模型大鼠單獨置于代謝籠內 4h,測試期間禁水禁食,單獨靜置,收集 4h 內大鼠的糞便,比較同日齡模型組與空白組幼鼠糞便差異,包括糞便溏稀程度、糞便形狀、糞便顏色改變、有無異物等。并根據 Bristol 大便性狀圖譜記錄大便性狀[7]( Bristol 大便性狀分型: 1 型為分離的硬團,2型為團塊狀,3 型為干裂的香腸狀,4 型為柔軟的香腸狀,5 型為軟的團塊,6 型為泥漿狀,7 型為水樣
便。其中 1、2 型為便秘( constipation) ; 3、4 型為正常( ideal stools) ; 5、6、7 為腹瀉( diarrhea or urgency) 。按照中國藥典附錄烘干法測定糞便含水量。
2. 2. 3 直腸敏感性測試在造模后的第 35 天、第 49 天、第 63 天對各組幼鼠進行大鼠的腹部回縮反射( AWR) 測試,將血壓計、針管與自制指套氣囊用三通管連接,用針管向氣囊內打氣時可以在血壓計上讀出氣囊內壓力。大鼠在自制的密封麻醉瓶進行yi醚麻醉后,把用石蠟油潤滑后的氣囊經肛men輕柔地插入約 3 ~ 5 cm,氣囊末端距肛men 1 cm,用膠布把導管和大鼠尾巴根部纏在一起,固定氣囊。大鼠蘇醒后,將其放在特制的不能轉身的透明塑料瓶內。15 min 后待大鼠適應環境,在大鼠意識完全清醒的情況下逐漸打氣擴張腸道,分別觀察引起大鼠腹部抬起以及背部拱起的壓力閾值,相應的 AWR 腹部有回撤反應的標準參照Al-Chaer[8]的方法進行評分。記錄第 2 分或第 3 分的壓力值,當大鼠出現 1 分或 4 分時,待大鼠充分休息后重新測試。為得到準確的評估結果,對每一閾值都重復進行 3 次擴張,數據取均值。
2. 2. 4 結腸 HE 染色分析正常組和模型組大鼠在第 42 日齡時,將實驗大鼠禁食 1d 后,腹腔注射 10% 水合氯醛( 0. 3 mL /100g) 麻醉處死大鼠,分離直腸和結腸,剪取乙狀結腸腸段 2cm 及近降結腸處直腸腸段 1 cm,水洗凈,浸入 5% 福爾馬林液中備用。使用脫水機和包埋機對大鼠標本進行石蠟包埋,標本用石蠟包埋后,放進全自動石蠟切片機中切片: 4℃ 冰箱預冷 40 min,以鋒利刀片切出 1 μm 的切片,貼附于載玻片上備用。大鼠的結腸標本完成包埋后,放進常規染色的說明書操作步驟進行操作。
2. 3 統計方法

應用 SPSS 13. 0 統計軟件包進行統計學處理,各組實驗數據均用均數 ± 標準差( x珋± s) 表示,組間變量比較用 t 檢驗,以 P < 0. 05 有統計學意義。

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